Minggu, 16 Desember 2012

KROMATOGRAFI




Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.
Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS),Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS).


Macam - Macam Kromatografi

Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesi. 

1. Kromatografi Kertas 




kromatografi kertas merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Teknik ini sangat sederhana. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.


2. Kromatografi lapis tipis





 


Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatograafi kertas, hanya bedanya kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel, selulosa atau materi lainnya.
Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.
Sebagai fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan ukuran 5 – 50 mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel  silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul – molekul pokar.
Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 – 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC selama beberapa jam.
(http://robbaniryo.com/ilmu-kimia/kromatografi-lapis-tipis-klt/)
            Pemisahan campuran dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu. Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis dengan jarak ternentu.

3. Kromatografi penukar ion




Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran. Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolom kromatografi.Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun1850. Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu:
  • Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif.Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus karboksil (-CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-). Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah asam sitratasam laktatasam asetatasam malonat, buffer MES dan fosfat.
  • kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan –N+(CH3)3. Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin.
Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekul protein (terutama enzim).Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawa alkoholalkaloidasam amino, dan nikotin.
        Fase Diam
Ada banyak macam penukar ion, tetapi penukar ion polisterina berikatan silang paling luas penggunaannya.Gambar 65. b menggambarkan struktur resina penukar anion dengan matriks poliestirena berikatan silang yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkilamonium. Resina poliestirena kerng cenderng mengembang jika dimasukkan dalam pelarut. Air menetrasi ke dalam resina dan hidrasi, membentuk larutan sangat pekat dalam resina. Tekanan osmosa cenderung menekan air lebih banyak ke dalam resina dan padatan itu mengembang, jadi volumenya bertambah. Jumlah air yang diambil resina tergantung pada ion penukar dari resina dan menurun dengan bertambahnya jumlah ikatan silang. Resina penukaran ion juga mengembang dalam pelarut organik, tetapi pengembangannya lebih kecil daripada dalam air.
Fase Gerak
Kebanyakan pemisahan kromatografi penukar ion dilakukan dalam media air sebab sifat ionisasi dari air. Dalam beberapa hal, digunakan pelarut campuran seperti air, alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak media air, reteni puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik dan oleh pH fasa gerak. Kenaikkan kadar garam dalam fasa gerak menurunkan retensi senyawa cuplikan. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion cuplikan bersaing dengan ion fasa gerak untuk gugus penukar ion pada resina.



4. Kromatografi elektroforesis

Kromatografi elektroforesis menyangkut perbedaan migrasi spesies-spesies bermuatan dalam suatu larutan di bawah pengaruh dari penggunaan suatu gradient potensial. Kecepatan migrasi setiap spesies tergantung atas ukuran, bentuk dan muatan spesiesnya. Metoda elektroforesis merupakan metoda pemisahan suatu  zat berdasarkan perbedaan muatan dan massa melekul relative dari komponen-komponennya.  Pemisahan terjadi karena perbedaan laju migrasi komponen-komponen bermuatan oleh pengaruh medan listrik.




5. Kroamatografi Gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).
Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.
Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.
Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.
Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.




SEKIAN--- SEMOGA BERMANFAAT :) 

Sabtu, 15 Desember 2012

ELISA ---> MINI VIDAS

ELISA adalah suatu metoda immunokimia yang berdasarkan reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikatornya. Dengan memiliki satu dari komponen tersebut (antigen atau antibodi) yang dilabel dengan enzim dan diikatkan dengan pendukung immunosorbent, maka akan terbentuk antigen-antibodi kompleks. Pada metoda ELISA dengan antigen kompetitif, antibodi dilapiskan pada immunosorbent (substrat padat). Kemudian antigen sampel dan antigen yang berlabel enzim dimasukan kedalam immunosorbent sehingga terjadi kompetisi antara antigen sampel dengan antigen berlabel enzim untuk berikatan dengan antibodi dan terbentuk kompleks antibodi-antigen. Dengan tambahan substrat yang spesifik terhadap kerja enzim, akan dihasilkan reaksi yang menghasilkan warna. Hasil warna tersebut dapat dilihat secara visual atau diukur dengan menggunakan kolorimeter atau spektrofotometer. Ciri utama metoda ini adalah menggunakan suatu indikator enzim untuk reaksi immunologi (Burgess, 1995). 
Teknik pengujian dengan metoda ELISA dapat dilakukan dengan beberapa konfigurasi, pemilihan konfigurasi tergantu
ng dari besar molekul yang akan dideteksi, serta tingkat sensitifitas dan spesifitas yang dikehendaki. Beberapa konfigurasi tersebut adalah:

A. ELISA Kompetitif
ELISA Kompetitif dapat dibedakan menjadi dua, yaitu: 
1. ELISA kompetitif langsung
Konfigurasi ELISA langsung merupakan konfigurasi paling sederhana. Antibodi spesifik dilapiskan pada mikroplat yang kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analat yang akan dideteksi bersama dengan enzim-hapten konjugat ditambahkan pada mikroplat yang telah dilapisi dengan antibodi. Analat dan enzim-hapten konjugat akan saling berkompetisi untuk mengikat antibodi yang dilekatkan pada permukaan mikroplat. Banyaknya enzim-hapten konjugat yang dapat mengikat antibodi dapat ditentukan dengan penambahan substrat senyawa pembentuk warna. Warna yang terbentuk akan berbanding terbalik dengan jumlah analat yang terdeteksi dalam contoh. Semakin banyak analat dalam contoh maka analat mempunyai kesempatan yang lebih besar untuk mengikat antibodi, sehingga akan lebih sedikit enzim-hapten konjugat yang mengikat antibodi. Akibatnya intensitas warna yang terbentuk berkurang karena enzim yang bereaksi dengan substrat juga lebih sedikit.
2. ELISA kompetitif tak langsung
Pada metoda ini menunjukan bahwa warna yang ditimbulkan tidak langsung disebabkan oleh antigen dan antibodi yang bereaksi. Dibutuhkan suatu antibodi antispesies yang dilabel dengan enzim. Antigen dalam hal ini hapten protein konjugat dilekatkan pada permukaan mikroplat dan kemudian diinkubasi selama waktu tertentu. Analit bersama dengan antibodi ditambahkan kedalam mikroplat. Antigen dan analat akan berkompetisi untuk mengikat antibodi yang ada. Makin banyak analat dalam contoh yang diuji maka semakin sedikit antigen yang dapat mengikat antibodi. Sehingga antibodi kedua yang berlabel enzim (antibodi antispesies) yang ditambahkan jumlahnya akan semakin sedikit, akibatnya intensitas warna yang ditimbulkan juga semakin rendah.
Kompetitif ELISA merupakan konfigurasi yang banyak digunakan untuk pengujian cemaran, toksin serta senyawa dengan berat molekul kecil.

B. ELISA on-kompetitive sandwich
Antibodi dilekatkan pada permukaan sumur-sumur mikroplat, kemudian antigen dan contoh uji ditambahkan dan diinkubasi selama waktu tertentu. Kemudian ditambahkan antibodi kedua yang diberi label enzim. Intensitas warna yang ditimbulkan setelah penambahan substrat berbanding lurus dengan antigen yang terdeteksi. Konfigurasi ini digunakan untuk mendeteksi makromolekul atau senyawa dengan molekul besar seperti protein dan mikroorganisme. Akan tetapi kurang sensitif untuk mendeteksi senyawa dengan berat molekul kecil seperti toksin dan cemar


 MINI VIDAS

Mini VIDAS adalah penganalisa immunoassay sepenuhnya otomatis dari Bio Merieux. Hal ini digunakan untuk melakukan tes Penyakit menular, koagulasi dan tes Immunochemistry menggunakan Elfa (Enzyme Linked Fluorescent Assay) teknologi. Ini mengurangi risiko dan membawa lebih dari hanya membutuhkan kalibrasi titik tunggal. Pilih Dealer Terkenal untuk Dapatkan Model Kualitas Tinggi Untuk membeli analisa immunoassay untuk media-ukuran laboratorium, mengumpulkan informasi yang cukup tentang berbagai model dan fitur mereka. Rupa sehingga menjadi lebih mudah untuk memilih produk yang sesuai untuk kebutuhan Anda. Model yang disebutkan di atas tersedia dari pedagang terkemuka di industri dengan harga terjangkau. 

Alat MINI VIDAS metode ELFA (Instalasi Imunologi)

Alat mini Vidas ini adalah salah satu alat yang digunakan padapemeriksaan Imunologi . Prinsip alat ini merupakan modifikasi dari prinsip ELISA hanyapembacaannya bedasarkan Flouresensi


                                                            Gambar Mini Vidas 
A.Komponen-komponen Minividas
 1.Tombol On/Of
 2.TraySebagai tempat untuk memasukkan strip yang berisi sampel danreagen
 3.Display (LayarTempat unttuk menampilkan program pada alat
 4.Printer
 5.Inkubatoruntuk proses inkubasi pada pemeriksaan, agar reaksi lebihsempurna biasanya digunakan suhu 37°C.

  
Dalam penggunaan alat ini ada beberapa hal penting yang perludiperhatikan:
1)Pemeriksaan dengan reagen yang baru terlebih dahulu lakukanpembacaan MLE pada alat secara otomatis agar no lot dan barkoddapat dibaca oleh alat ( no lot yang belum perna dilakukan). Apabilapemeriksaan dilakukan tanpa membaca MLE maka hasil tidak akankeluar.
2)SPR dan strip reagents yang digunakan harus sama (misalnya untukpemeriksaan AFP, gunakan SPR AFP dan strip AFP)
3)Setiap satu SPR dan satu strip reagent hanya untuk satu test dan sekalipakai
4)Kalibrasi dan running control sebaiknya dilakukan setiap 14 hari sekali
5)Untuk mengetahui kapan kalibrasi suatu assay harus dilakukan kembali,dari Menu Utama tekan Master Lot Menu, lalu tekan List Stored Stds,pilih assay beserta nomor lot yang dikehendaki.
6)Tidak ada maintenance harian, mingguan, atau bulanan.
7)Maintenance yang dilakukan hanya membersihkan ke-6 jalur tray padasection A ataupun section B menggunakan dadu busa.
8) Setelah selesai digunakan mini vidas dapat langsung dimatikan tanpaharus melalui prosedur khusus.
9)Apabila mini vidas akan dipindah posisikan atau letaknya, maka harus dilakukan Park System dengan cara:Dari Menu Utama, tekan Utility Menu, tekan Misc. Functions, lalu tekan Park System.


B.Perawatan
1. Perawatan Harian:
-Matikan alat setelah selesai digunakan
-Bersihkan tray dari kotoran. atau debu dengan menggunakan spondadu atau dengan tissu

2. Perawatan 6 bulan :
-Lakukan kalibrasi pada alat secara keseluruhan seperti Lampu,proses pembacaannya.



C. Prosedur pengoperasian Mini vidas

1. Menyalakan UPS
2. Tekan tombol on/off yg terdapat pd bagian belakang alat
3. Alat akan melakukan inisialisasi/warming up ± 10 menit
4. Setelah selesai, pd layar tampil Menu Utama sebagai berikut:START SECTIONSTATUS SCREENMASTER LOT MENURESULTS MENUUTILITY MENUSambungkan UPS pd ListrikPilih status SCREEN untuk masuk pd program pememeriksaan





i