Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alatyang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi.Filter Sinar
λ (nm) <400 400-450 450-500 500-570 570-590 590-620 620-750 >750
warna UV Violet Biru Hijau Kuning Jingga Merah Infra Merah
Penyerapan sinar uv dan sinar tampak o/ molekul, melalui 3 proses yaitu :
1. Penyerapan o/ transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.
2. Penyerapan o/ transisi electron d dan f dari molekul kompleks
3. Penyerapan o/ perpindahan muatan.
Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb :
E = hv
Dimana , E = energy (joule/second)
h = tetapan plank
v = frekuensi foton
Penyerapan sinar uv-vis dibatasi pd sejumlah gugus fungsional/gugus kromofor (gugus dengan ikatan tidak jenuh) yang mengandung electron valensi dengan tingkat eksitasi yang rendah. Dengan melibatkan 3 jenis electron yaitu : sigma, phi dan non bonding electron. Kromofor-kromofor organic seperti karbonil, alken, azo, nitrat dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimalnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elekron bebas, seperti hidroksil, metoksi dan amina. Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar (bathokromik) yang disertai dengan peningkatan intensitas (hyperkromik).
Komponen dari suatu spektrofotometer berkas tunggal :
1. Suatu sumber energy cahaya yang berkesinambungan yang meliputi daerah spectrum dimana instrument itu dirancang untuk beroperasi.
2. Suatu monokromator, yakni suatu piranti untuk mengecilkan pita sempitpanjang-panjang gelombang dari spectrum lebar yang dipancarkan oleh sumber cahaya.
3. Suatu wadah sampel (kuvet)
4. Suatu detector, yang berupa transduser yang mengubah energy cahaya menjadi suatu isyarat listrik.
5. Suatu pengganda (amplifier), dan rangkaian yang berkaitan membuat isyarat listrik itu memadai untuk di baca.
6. Suatu system baca (piranti pembaca) yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan (% T) maupun Adsorbansi (A).
Skema spektrofotometer ;
Sumber Cahaya..Monokromator….Sampel…Detektor….Amplifier..Piranti Pembaca/Penunjuk
Beberapa jenis spektrofotometer :
1. Spektrofotometer UV-Vis
2. Spektrofotometer Infra merah
3. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA)
4. Spektrofotometer Resonansi Magnetik (NMR)
5. Spektrofotometer Pendar Molecular (pendar fluor/pendar fosfor)
6. Spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya ( nefelometer, turbidimeter dan spektrofotometer Raman)
Hubungan antara warna dengan panjang gelombang sinar tampak.:
Panjang gelombang warna yang diserap warna komplementer
400-435 nm ungu (lembayung) hijau kekuningan
450-480 nm biru kuning
480-490 nm biru kehijauan orange
490-500 nm hijau kebiruan merah
500-560 nm hijau merah anggur
560-580 nm hijau kekuningan ungu (lembayung)
580-595 nm kuning biru
595-610 nm orange biru kekuningan
610-750 nm merah hijau kebiruan
Pergeseran-pergeseran :
1. Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan energy yang lebih rendah.2. Hypsokromik(pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih pendek.
3. Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar.
4. Hypokromik, reduksi absortivitas molar.
Penerapan spektrofotometrik
Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan.
Hukum Bouguer (Lambert) : Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen dalam lapisan-lapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang memasuki lapisan itu dalam fraksi yang sama seperti lapisan-lapisan lain. Dengan semuanya yang lain sama, maka absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan yang melewati medium.
Gabungan Hukum Bouguer-Beer, sering di tuliskan sebagai A = abcatau A = εbc
Dengan A = absorbans
ε = absorpsivitas molar (jika konsentrasi dalam molar) dengan satuan M-1cm-1
a = absorpsivitas (jika konsentrasi dalam %b/v) dituliskan E1%1cm
b = panjang jalan/kuvet
c = konsentrasi ( dalam molar atau %b/v)
Spektra absorpsi sering diyatakan dalam %T maupun dalam bentuk A (absorbansi)
Maka, A = – log (%T)
A = log (Po/P), Po adalah daya cahaya masuk dan P adalah daya yang diteruskan melewati sampel.
Beberapa Istilah Dalam Spektrofotometri
Absorbans (A) , A = log (Po/P)
Absorptivitas (a), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan dalam %b/v dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per gram per sentimeter.
Absorptivitas molar (ε), tetapan dalam Hukum Bouguer-Beer bila konsentrasi dinyatakan dalam molar dan tebal kuvet dalam cm. Dengan satuan liter per mol per sentimeter.
Transmitan (T), fraksi dari daya radiasi yang diteruskan oleh suatu sampel T = P/Po. Sering dinyatakan sebagai suatu persentase : %T = (P/Po) x 100%.
• Keuntungan Spektrofotometer
Keuntungan dari spektrofotometer adalah yang pertama penggunaannya luas, dapat digunakan untuk senyawa anorganik, organik dan biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra lembayung atau daerah tampak. Kedua sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untuk mengabsorpsi pada jarak 10-4 sampai 10-5 M. Jarak ini dapat diperpanjang menjadi 10-6 sampai 10-7 M dengan prosedur modifikasi yang pasti. Ketiga selektivitasnya sedang sampai tinggi, jika panjang gelombang dapat ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri, persiapan pemisahan menjadi tidak perlu. Keempat, ketelitiannya baik, kesalahan relatif pada konsentrasi yang ditemui dengan tipe spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1% sampai 5%. Kesalahan tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen dengan perlakuan yang khusus. Dan yang terakhir mudah, spektrofotometer mengukur dengan mudah dan kinerjanya cepat dengan instrumen modern, daerah pembacaannya otomatis (Skoog, DA, 1996).
• Tipe Instrumen Spektrofotometer
Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam dandouble-beam. gambar Single-beam instrument dan Double-beam instrument
Single-beam instrument
Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).
Double-beam instrument
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan fotodetektor yang keluar menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA, 1996).
• Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna.
• Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan :
1. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu , reaksinya selektif dan sensitif, reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel, hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama, dan waktu operasional. Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.
2. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu yang pertama, pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Kedua disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum lambert-beer akan terpenuhi.Dan yang ketiga jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal (Rohman, Abdul, 2007).
